Se estudia por primera vez la diversidad y estructura genética de 23 poblaciones naturales de T. melanosporum de distribución española. Para este objetivo se emplearon los marcadores moleculares ISSR. El buen estado de conservación genético de la mayoría de las poblaciones de Tuber melanosporum se demostró con los altos niveles de diversidad genética detectados. Esta alta diversidad es consecuencia de la amplia distribución geográfica de la especie, de su dispersión zoócora y corroboran su heterotalismo. Los resultados mostraron una alta estructura genética poblacional (47,89 %), diferenciándose dos grandes grupos genéticos en España separados por el Sistema Ibérico. Éstos resultados y la singularidad genética de algunas poblaciones (Jaén, Murcia, Navarra, Soria, Guadalajara y Lérida) sugieren la supervivencia de éstas durante la última glaciación en zonas que podrían haber actuado como refugio para su posterior dispersión hacia otras zonas calcáreas de la península Ibérica y de Francia. Se proponen microreservas como estrategia in situ para el manejo y conservación de la especie, así como la creación de un banco de germoplasma que respete la estructura genética detectada.